单细胞文章解析（5）：A single-cell RNA sequencing profiles the developmental landscape of Arabidopsis root

文章概述

真核生物的各个组织中细胞类型多样。近年来，随着单细胞转录组测序技术和分析方法的发展使我们能够探索个体组织中细胞类型的异质性以及其动态发育过程中相关的转录调控机制。该研究中，作者通过高通量单细胞转录组测序技术，从单细胞转录组的角度发现了拟南芥的细胞具有高度的异质性。经过分析，本文共鉴定出24个细胞类群。不同发育阶段的细胞在空间上的分布和时间上的顺序，说明了它们具有较为清晰的层次结构。此外，作者还发现根中不同的细胞类群对离子和激素表现出不同的响应。总的来说，该研究揭示了拟南芥根细胞高度的异质性，并在单细胞分辨率下对根细胞分化过程中的中间状态进行了研究。

研究背景

由于在根的顶端区域存在分生组织（root apical meristem，RAM），因此植物根部表现出一种连续的生长特征。与动物一样，根顶端分生区中的干细胞，同样以自我更新的方式进行分裂，而且可以分化为其他类型的细胞。RAM的功能是维持细胞的全能性，通过细胞的分裂、增殖和分化产生多种细胞类型，其中包括：表皮、根毛、根冠、皮层、内皮层和中柱细胞（由中柱鞘、韧皮部、木质部和原形成层组成）。因此，沿着根的纵轴向茎的方向细胞类型逐渐增多。

拟南芥根发育的分子机制已被广泛研究。研究表明，植物激素和转录因子在RAM的维持和细胞分化中起着关键作用。例如，高生长素浓度与内胚层中部分转录因子的交互作用控制着QC的定位。WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX 5(WOX5)是一个在干细胞组织中心特异表达的HOMEOBOX家族基因，其通过抑制分化因子CYCLING DOF FACTOR 4(CDF4)的表达来维持小柱干细胞的全能性。因此，WOX5的功能缺失导致柱干细胞和侧根冠细胞分化，而该基因的过量表达可导致整个根冠中的细胞处于未分化状态。一般认为根尖干细胞微环境的建立和维持受到两条核心转录因子通路的严格控制：即纵向的PLETHORA (PLT)途径和径向的SHORTROOT (SHR)/SCARECROW (SCR)途径。PLT通过激活细胞分裂和生长相关基因以及抑制分化的基因来协调根部细胞的分裂、生长和分化。最近研究发现，生长素和分裂素的空间分布与转录因子PHLOEM EARLY DOF (PEAR)和microRNA165/6-targeted HD-ZIP III相一致，在形成层干细胞和原形成层细胞发育中形成调控网络。

测序数据介绍

材料：The wild-type A. thaliana (ecotypes Col-0)

时期：The root tissues were harvested after 10 days of growth

部位：The root tip regions (0.5 cm in length from root tip) were harvested and digested for 2 h at room temperature in RNase-free enzyme solution.

测序方法：The cells were then processed with the 10x Genomics Single Cell Protoco.The libraries were constructed using Chromium Controller and Chromium Single Cell 30 Reagent Kits v2.

主要结果

1 拟南芥根尖组织主要细胞类型

经质控过后，本文共获取7695个细胞。通过降维聚类，这些细胞共分为24个细胞类群，主要细胞类型为：中柱细胞，根冠细胞，根毛细胞，韧皮部细胞，内皮层细胞，分生组织细胞，木质部细胞，表皮细胞，侧根细胞以及光合作用细胞。

关于该分类结果有以下三点值得观察：（1）分化程度较为成熟的细胞类型较为离散分布，而分化程度较低的细胞类群却聚集在一起；（2）同一个细胞类型可能由不同的细胞亚群组成，不同的亚群具有不同的GO功能；（3）作者发现了新的细胞类群，例如Cluster 24主要富集与光合作用相关的基因，因此在有一些根部的细胞可能与叶肉细胞一样具有光合作用的潜能。

2 构建根部细胞发育轨迹

2.1 根分生组织发育轨迹

由于大量与生长素响应相关的基因（例如，IAA33、ARF5、ARF10、YUC3、YUC8、YUC9）以及根分生组织特异性表达的基因（例如，PLT1、RGF2、RGF3）在Cluster12和Cluster19中表达，因此Cluster12与Cluster19在本研究中被鉴定为干细胞龛（SCN）。静止中心细胞分布于两个细胞类群中。

有趣的是Cluster14在拟时序轨迹中与Cluster12和Cluster19形成分叉独自形成分支（Fig 2）。对该类群进行GO分析发现，其主要富集于细胞分裂功能。而且在该类群的表达水平较高的基因中存在两个MYB家族的转录因子MYB88和MYB124。这两个转录因子通过抑制CDKB1;1的转录从而抑制细胞分裂促进细胞的分化。细胞伸长相关的基因AGP12、AGP21、XTH20和PIP2.1在Cluster14的拟时序后期的表达水平急剧升高。综上所述，Cluster14中的细胞应该属于近端分生组织细胞（roximal meristem，PM）。

2.2 根冠细胞分化轨迹

根冠在保护根尖，养分吸收以及感知周围环境中起到了重要作用。表皮或根冠初始化细胞分化为表皮细胞和根冠细胞，然而根冠柱初始化细胞分化成为根冠中的根冠柱细胞。为了描述上述分化过程，作者对Cluster4,5和19这是三个细胞类群进行了拟时序分析（Fig 3）。在拟时序分析结果中可以发现，三个类群的细胞形成了两个分支，分别是根冠柱（Cluster4）和侧根冠(Cluster5)。

3 细胞类群对离子吸收和激素响应的差异性

植物激素对根系发育和胁迫反应非常重要。作者通过观察与植物激素响应，运输和合成的基因在该单细胞数据中的表达（Fig 4），发现与生长素吲哚乙酸合成相关的基因在Cluster1中具有很高的表达水平。然而和油菜素类固醇生物合成相关的基因在Cluster7中表达。因为Cluster1和7都属于韧皮细胞或中柱鞘细胞，因此该细胞类型与植物激素合成相关。脱落酸、乙烯、茉莉酸和水杨酸是应对环境刺激的四种主要激素。响应这四种激素的基因主要在根冠柱细胞和内皮层细胞表达。

最近研究发现，根毛的密度与铬离子的浓度呈正相关。在Cluster8和17（root hair）中我们发现大量与铁离子、钙离子转运的基因在这两个类群中表达。

综上所述，这些结果表明，单细胞测序技术对于单细胞分辨率下研究与激素反应和离子吸收相关的生物过程是强有力的。

4 细胞分裂素对侧根冠生长发育的影响

通过观察细胞分裂素和生长素信号通路中的基因在根冠和侧根冠细胞中的表达分布，作者发现与生长素相关的基因主要在根冠细胞中表达，而与细胞分裂素相关的基因主要在侧根冠细胞中表达。在整个拟时序中，随着细胞分化的成熟，其相关基因表达水平也逐渐降低（Fig 3）。上述结果与之前的研究发现的结论相一致（Fig 5）。

在侧根冠处可以观察到四层细胞。B-ARR基因的双突植株中，侧根冠与野生型并无区别，但是在三突（arr1,arr10,arr12）植株中，其细胞分裂素信号输出受阻，从而使侧根冠细胞层数降低（Fig 5C）。这些结果证明了在侧根冠发育过程中细胞分裂素起到了重要的作用。

总结

作者通过对拟南芥根尖组织进行单细胞测序，将细胞分成了24个细胞亚群，主要由10种细胞类型组成。通过拟时序分析作者鉴定出干细胞龛细胞与近端分生组织细胞。通过对根冠部位相关细胞类群的拟时序分析，作者构建出根冠柱与侧根冠细胞的分化轨迹，并鉴定出参与该分化过程的关键调控基因。作者通过观察植物激素合成、响应和运输相关的基因，发现它们在各个类群中的表达具有较大的差异性。而且与离子吸收相关的基因同样也表现出相同的差异分布。最后，作者通过对侧根冠分化轨迹中关键基因B-ARR基因突变植株的观察发现，细胞分裂素对于侧根冠的形成和发育至关重要。